酶抑制法快速檢測有機磷農(nóng)藥殘留的研究進展

農(nóng)藥作為重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料,在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中對病、蟲、草、鼠害的防治起到了非常重要的作用,為人類創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益,但同時也給環(huán)境安全和人體健康帶來了一定威脅. 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用的殺蟲劑農(nóng)藥主要可分為四大類:第一類是有機氯殺蟲劑,這類殺蟲劑由于致畸、致癌和致突變等缺點,已停止生產(chǎn)和使用;第二類是有機磷殺蟲劑;第三類是氨基甲酸酯類殺蟲劑;第四類是擬除蟲菊酯類殺蟲劑. 在所有的農(nóng)藥中,有機磷農(nóng)藥主要是殺蟲劑,由于其品種多、防治對象多及殺蟲效率高等特點,而在各種農(nóng)作物尤其是水果蔬菜生產(chǎn)中得到最廣泛的應用 . 有機磷農(nóng)藥中的部分品種具有高毒性的特點,大量使用會造成環(huán)境污染、作物藥害及人畜中毒. 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界每年農(nóng)藥中毒人數(shù)約300 萬人,其中有機磷農(nóng)藥中毒占70 %. 我國專家對為數(shù)眾多的農(nóng)藥品種進行分級排隊,從中篩選出的十種強污染農(nóng)藥中,有七種屬于有機磷類,可見,農(nóng)藥殘留檢測的重點應該放在有機磷類殺蟲劑.目前,我國農(nóng)藥殘留快速檢測技術應用最多的是酶抑制法,其較高的專一性、靈敏性和準確性及低成本等優(yōu)點已受到人們的廣泛關注. 筆者主要針對乙酰膽堿酯酶和植物酯酶兩種酶在快速檢測有機磷農(nóng)藥殘留中的應用研究作一綜述.

1. 1 　有機磷農(nóng)藥的特點

早在20 世紀30 年代,德國的Schrader 就合成了一系列有機磷酸酯類化合物,并發(fā)現(xiàn)其中一些具有殺蟲殺螨活性. 目前全世界有機磷殺蟲劑的品種約為100 余種,常用的有50 多種. 我國農(nóng)藥市場上有機磷品種30 余個,占我國殺蟲劑品種的38 % ,而產(chǎn)量卻占75 %. 有機磷殺蟲劑作為我國使用最廣泛、用量最大的一類殺蟲劑,有機農(nóng)藥一般都會殘留在土壤、或飲用水中，然后通過生物鏈進入植物、動物體內(nèi)，再到人體內(nèi)。那么如何去測定土壤中農(nóng)藥的殘留量，我們可以通過測土儀來測定。它可以測出氮、磷的含量，從而推斷出是否含有農(nóng)藥成分。農(nóng)藥品種繁多,性能也千差萬別. 綜合起來主要具有以下幾個方面的特點:

(1) 在自然環(huán)境和動植物體內(nèi)易降解. 正確使用時殘留問題小,不致污染環(huán)境且在高等動物體內(nèi)無累積毒性; (2) 殺蟲效率高,廣譜,作用方式多樣(如觸殺、胃毒、熏蒸) ; (3) 毒性差異大. 辛硫磷、馬拉硫磷及敵百蟲等毒性低,而對硫磷、甲拌磷為劇毒品種.總的來說,有機磷殺蟲劑的毒性偏高; (4) 易解毒.對有機磷殺蟲劑引起的急性中毒有特效的解毒藥,如解磷定和阿托品; (5) 與有機氯農(nóng)藥、擬除蟲菊酯類殺蟲劑相比,害蟲對有機磷殺蟲劑的抗藥性發(fā)展緩慢.

1. 2 　有機磷農(nóng)藥的毒性

作為典型的酶毒劑,有機磷農(nóng)藥可以通過消化道攝入,也可以通過皮膚、粘膜、呼吸道吸收. 有機磷的急性毒性主要歸因于對膽堿能神經(jīng)突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶活性的抑制,使酶不能起催化乙酰膽堿水解的作用,導致組織中能使神經(jīng)過度興奮的乙酰膽堿過量蓄積. 這種乙酰膽堿傳導介質(zhì)代謝紊亂,可導致遲發(fā)性神經(jīng)毒性,引起運動失調(diào)、昏迷、呼吸中樞麻痹、癱瘓甚至死亡. 有實驗證明對氧磷和對硫磷酰化人腦膽堿酯酶一般約經(jīng)4 d 即“老化”,酶活不易再恢復.

目前檢測有機磷農(nóng)藥殘留普遍采用的方法有:色譜法、波譜法和酶抑制法. 色譜法檢測準確,靈敏度高,但成本高,測定時間長,且需要具有一定技術水平的專業(yè)人員才能進行操作,只適合在實驗室分析;波譜法干擾因素多,靈敏度不高,易出現(xiàn)假陰性結(jié)果,一般只能作為鑒別方法粗選;酶抑制法具有操作簡便,速度快,適合現(xiàn)場檢測和大批樣品篩選檢測和我國小規(guī)模、分散的銷售體系中經(jīng)常性的現(xiàn)場快速檢測,因此作為一種檢測農(nóng)藥的常用方法得到廣泛應用. 而如何選擇酶源是實現(xiàn)快速、準確檢測的關鍵.

2. 1 　酶的來源

膽堿酯酶廣泛存在于動物的組織中,1953 年stedman 等首先從馬血清中分離出乙酰膽堿酯酶,此后不同來源的乙酰膽堿酯酶相繼得到純化和研究 . 目前已分離純化的動物來源的乙酰膽堿酯酶主要集中在動物肝臟和血液,如豬肝,雞血等. 也有利用蚯蚓以及海洋魚類,甲殼類動物的神經(jīng)組織,腦組織分離乙酰膽堿酯酶. 近年來很多學者致力于從昆蟲體內(nèi)提取乙酰膽堿酯酶如:家蠅、麥二叉蚜、黃猩猩果蠅、煙草天蛾、光葉庫蚊、黃粉甲、美洲淤夜蛾、豆莢草盲蝽、馬鈴薯葉甲、騷擾角蠅及棉鈴蟲等. 迄今為止,酶抑制法進行農(nóng)藥殘留檢測以從敏感家蠅中提取的乙酰膽堿酯酶效果最佳,其敏感性優(yōu)于其他來源的乙酰膽堿酯酶,更有進一步研究表明,家蠅羽化后2～3 d 時其頭部的乙酰膽堿酯酶敏感性最高.植物來源的酯酶作為農(nóng)藥殘留檢測的三種酶標記物之一,由于其來源廣泛、價格低廉,近年來得到了較多的關注. 但是,幾乎所有的研究都是直接以面粉作為酶源,篩選用于農(nóng)殘檢測的最佳小麥品種或者是以面粉作為酶標記物,制成酶片,對酶片檢測農(nóng)殘顯色反應的溫度、時間、顯色劑的選擇等方面進行比較研究. 尚未見到用提取純化的純酯酶制品對大量有機磷農(nóng)藥的敏性和最低檢測限進行研究的報道.

2. 2 　兩種酶抑制法的比較研究

酶抑制法測定有機磷農(nóng)藥殘留是根據(jù)有機磷農(nóng)藥的毒性對酶分解底物的抑制作用進行的,其酶源有來自動物的膽堿酯酶和從植物中提取的植物酯酶.動物膽堿酯酶法是基于有機磷農(nóng)藥的毒性抑制乙酰膽堿酯酶催化底物水解生成乙酸和膽堿,后者與5 ,52二硫代2雙222硝基苯甲酸反應,生成黃色產(chǎn)物52硫代222硝基苯甲酸,其在410 nm 處有最大吸收,測定其在單位時間內(nèi)的生成量,即可測得乙酰膽堿酯酶的活性.植物酯酶可以催化乙酸萘酯水解為萘酚和乙酸,萘酚與顯色劑固藍B 作用形成紫紅色的偶氮化合物,從而發(fā)生顯色反應。

有機磷農(nóng)藥能抑制植物酯酶的活性,使反應速率發(fā)生變化,紫紅色的偶氮化合物產(chǎn)量不同,吸光度值也不同,即酶的活性受到抑制的程度不同.很多學者經(jīng)過大量實驗,比較了動物酯酶和植物酯酶反應的條件、總酯酶活力和靈敏度,并對其檢測條件進行了優(yōu)化,如2004 年黃志勇等比較了快速測定蔬菜中有機磷農(nóng)殘的膽堿酯酶抑制法和植物酯酶抑制法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種酶抑制快速測定方法均可用于蔬菜中有機磷農(nóng)殘的測定,其加標回收率都達到85 %以上,但植物酯酶法的測定偏差小于3 %,精密度較前者更勝一籌. 而后對植物酯酶和動物酯酶在不同p H 值下的酶活、抑制程度等性質(zhì)進行的實驗研究也表明了動物酯酶中的蒼蠅酶、蠅蛆酶與植物酯酶中的小麥酯酶相比,它們的活力和被農(nóng)藥抑制程度處于相近的水平,蒼蠅酯酶在p H 為6. 5時抑制程度最大為71 % ,植物酯酶在p H 為6. 0 時抑制程度達到了73 %. 植物酯酶抑制法對久效磷、樂果及辛硫磷的最低檢出限范圍為0. 03～0. 40mg/ kg ,而動物酯酶抑制法對相應農(nóng)藥的最低檢出限為0. 04～0. 50 mg/ kg . 可見,植物酯酶與動物酯酶均可用于蔬菜中有機磷農(nóng)藥殘留的快速測定,與動物酯酶相比,植物酯酶的酶活、抑制程度等各項指標均不遜色,且具有來源方便、成本低的優(yōu)勢.

2. 3 　動物膽堿酯酶法

自從1951 年發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥在體外也能抑制膽堿酯酶以來,絕大多數(shù)研究都是基于動物膽堿酯酶這一原理進行的. 目前,膽堿酯酶法檢測有機磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及膽堿酯酶生物傳感器法.

2. 3. 1 　酶片法

酶片法是將敏感生物的膽堿酯酶和生色基質(zhì)液經(jīng)固化處理后加載到濾紙片或類似載體物質(zhì)上,基質(zhì)在膽堿酯酶的催化作用下迅速分解,生成膽堿(藍色) 和乙酸. 有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用,使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變. 若膽堿酯酶受到抑制,基質(zhì)就不能水解、不變色,表明樣品中含有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥(呈陽性) . 目前廣泛使用的速測箱、速測卡法均屬于酶片法.近年來國內(nèi)常見的用固化含有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的試紙片建立的適合我國蔬菜中部分農(nóng)藥殘留限量的現(xiàn)場監(jiān)督檢測的速測卡法,其檢出限一般在0. 3～3. 5 mg/ kg ,檢出時間為15 min 操作簡單,速度快,測試成本低廉. 也有學者利用馬血清中的乙酰膽堿酯酶與底物氯化乙酰膽堿作用,根據(jù)反應前后的p H 值變化及指示劑的顏色變化情況,建立的一種可以作定性及半定量分析的酶片快速檢測法,應用于實際檢測黃瓜中農(nóng)殘的效果較好. 在國外方面,Hwa2Young No 和Young Ah Kim等用涂有乙酰膽堿酯酶的試紙檢測樣品中農(nóng)藥殘留的含量,實驗表明以Hybond N + 為酶載體,苯基乙酸酯為底物最合適,此時有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限分別為10 - 6 ～102 μg/ mL 和10 - 6 ～100μg/ mL ,實驗還發(fā)現(xiàn):與對氧磷相比,試紙法對被氧化的對氧磷更敏感.

2. 3. 2 　酶抑制分光光度法

有機磷類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶活性有抑制作用,濃度越高,抑制率越高. 通過分光光度計測定吸光度隨時間的變化值,并與空白對照比較求得酶抑制率,從而判定樣品中是否有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在. 該法所需儀器設備簡單、靈敏度高、前處理簡單、檢測時間短, 可及時檢測含農(nóng)殘的蔬菜.曾有報道以雞腦為酶源提取乙酰膽堿酯酶,利用酶抑制分光光度法檢測油白菜中有機磷農(nóng)藥(對硫磷、辛硫磷、氧化樂果) 的殘留量,可使3 種農(nóng)藥的回收率分別達到97 % , 101 %和99 %. IngridWalt 等從鐮刀菌pisi 中提取角質(zhì)酶,利用酶抑制分光光度法和96 孔板法同時檢測多個樣品中有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的含量,該法對毒死蜱和對氧磷的檢測限分別為2. 6 mg/ L 和0. 04 mg/ L .

2. 3. 3 　膽堿酯酶生物傳感器

膽堿酯酶生物傳感器法是目前農(nóng)藥殘留速測技術中的研究熱點,其在研究方法多樣化、靈敏度、準確性、響應時間等方面都具有很大優(yōu)勢.

(1) 電化學型:電化學型生物傳感器是基于膽堿酯酶催化底物水解生成電活性物質(zhì)的反應而構(gòu)建. 通常采用電化學氧化法直接測定生成的巰基膽堿或者先用膽堿氧化酶氧化生成的膽堿,進一步用電化學方法測量在此催化氧化過程中消耗的O2 或生成的H2O2 . Andreescu 等以果蠅中提取的膽堿酯酶為酶源,以苯乙酸酯為底物,Ag/ Al 參考電極,研制了一種絲網(wǎng)印刷電化學傳感器,其對對氧磷和毒死蜱的檢測限分別為5. 2 ×10 - 3 mg/ L 和0. 56 ×10 - 3 mg/ L .

(2) 光化學型:構(gòu)建光化學型生物傳感器的基礎是膽堿酯酶催化底物水解生成光活性物質(zhì)的反應. 在酶水解底物乙酰膽堿過程中,生成的乙酸引起溶液p H 降低,可引起p H 指示劑溴甲酚紫的顏色變化. 根據(jù)這一原理,已構(gòu)建了一種具有三層生物活性膜的“三明治”型生物傳感器. 膽堿酯酶被固定在外層的經(jīng)親水修飾的聚偏氟乙烯膜上,中間層為同溴甲酚紫混在一起的溶膠凝膠層, 下層為玻璃片. 同樣,也有根據(jù)溶液p H 降低引起p H 指示劑氯酚紅顏色變化的原理,將AChE 及氯酚紅分別共價固定在可控多孔玻璃球上,建立了一種流動式注射分析方法. Pardo2Yissar 等則設計了一種AChE 與經(jīng)化學修飾的CdS 納米離子相結(jié)合的光電流傳感系統(tǒng). 在AChE 抑制劑存在情況下,AChE的催化活性受到抑制,水解產(chǎn)物巰基膽堿的量降低,引起光電流減小. 這種酶與CdS 納米離子聯(lián)合的光電流傳感系統(tǒng)有可能發(fā)展為一類通用的生物傳感模式.

(3) 壓電型:設計壓電型生物傳感器的基本思路就是將膽堿酯酶(ChE) 或其抑制劑固定于石英晶體表面,當待測的ChE 及其抑制劑與所固定的識別物相互作用而產(chǎn)生特異結(jié)合時,將導致晶體表面質(zhì)量負載的改變,通過傳感器的頻率變化加以檢測.Abad 等采用直接吸附和共價結(jié)合兩種方式將AChE 固定在石英晶體表面制成壓電生物傳感器.利用有機磷抑制固定化的AChE 與吲哚乙酸生成不溶性靛藍染料的反應,測定壓電晶體的振蕩頻率的變化. Makower 等建立了一種競爭親合分析法,對氧磷作為識別元件通過螯合作用被固定在壓電傳感器金電極的表面. 經(jīng)過對氧磷修飾后的表面可以同BChE 結(jié)合,當樣品中存在殺蟲劑時,電極表面結(jié)合的BChE 量就會減少 . ChE 可以與可卡因類化合物相結(jié)合,酶催化速率水解常數(shù)非常小. 基于此,Knosche 等將可卡因的衍生物苯甲酰愛岡寧(benzoylecgonine) 固定在壓電晶體表面,并研究了其與AChE 結(jié)合的動力學特性,結(jié)果表明,苯甲酰愛岡寧可作為親和配基用于生物傳感分析.Nunes 等制成了膽堿酯酶(ChE) 的電流型生物傳感器,可用于谷物等樣品中氨基甲酸酯類殺蟲劑涕滅威、西維因、滅多蟲和殘殺威的測定,測定線性范圍為5 ×10 - 5μg/ g ,檢測限為1 ×10 - 4 ～3. 5μg/ g.Holger Schulze 等將AchE2傳感器直接應用于以N2溴代丁二酰亞胺為氧化劑,以異辛烷為萃取劑萃取的植物樣本,此法檢測時間為2 h ,重復率為84 %,對氧磷的檢測限可達2 μg/ kg ,達到歐盟食品農(nóng)藥殘留的安全限值。

2. 4 　植物酯酶抑制法

酶法快速檢測農(nóng)藥殘留的方法中,多采用敏感家蠅頭部獲得的乙酰膽堿酯酶,但是動物酯酶常表現(xiàn)為保持期短,需冷凍低溫保存. 而植物酯酶酶源豐富,提取和保存較為方便,只需以一定比例的水或緩沖液混合離心獲得的上清液即可作為粗酶液,并在- 4 ℃保存即可. 而且與動物酯酶相比,植物酯酶抑制法的測量準確度和精密度均不遜色,能達到快速檢測農(nóng)藥殘留的目的.

1987 年,中國農(nóng)業(yè)部環(huán)保所研制出一種酶片和顯色基質(zhì)片,不需儀器,即可在田間或菜市場快速測定蔬菜和水果中的有機磷類農(nóng)藥,其檢測限為0. 5～10 mg/ kg. 而后有人利用自制的植物酶片和高靈敏度化學檢測液(速測靈) ,使檢測出有機磷農(nóng)藥殘留的靈敏度達到0. 4～10 mg/ L 和0. 18～10 mg/kg ,檢測時間為5～10 min ,檢測成本為0. 2～0. 3元人民幣. 至此,植物酯酶法檢測有機磷農(nóng)藥殘留開始受到了研究學者的廣泛關注,各方面的研究也隨即展開.

在酶源的篩選方面,依據(jù)對有機磷農(nóng)藥的敏感性而定,許多研究者直接從面粉中提取酶,但不同的小麥酶對農(nóng)藥的敏感性不同即使對于同一品種小麥,產(chǎn)地不同、種植方法不同、所處生長期不同時,其對農(nóng)藥的敏感度也會存在較大差異. 因此,需要作進一步的研究,以確定可以進行定量分析而且具有互換性的植物酯酶酶源.

在顯色液方面,由于酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留常需借助于固藍B 鹽和乙酸萘酯組成的生色基質(zhì)液的顯色完成. 但該顯色液非常不穩(wěn)定,在室溫下40min 以后顯色能力大大下降,不能再用來測定,需現(xiàn)用現(xiàn)配,這給檢測工作帶來了諸多不便. 為此,董劑,大大延長了顯色劑的有效使用期限,使其在室溫下放置3 個月后性能不變,且該法對甲胺磷、敵敵畏、對硫磷及辛硫磷等的檢出體積分數(shù)為10 - 4 ～10 - 7 . 也有學者改用其它顯色劑如2 ,62二氯乙酰靛酚,先用植物酯酶水解橙色的2 ,62二氯乙酰靛酚,然后用分光光度法測定分解的靛酚(藍色) 吸光度,計算可得有機磷的含量,該法對常用的幾種有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的測定限均在0. 001 5～0. 3300 mg/ L 范圍內(nèi). 通過進一步實驗比較兩種不同顯色劑(2 ,62二氯靛酚乙酯和固藍B 鹽) 的顯色原理與性能,證實了采用2 ,62二氯靛酚乙酯既兼顧了底物和顯色劑的雙重作用,且從顯色底物液使用的方便程度、穩(wěn)定性以及便于現(xiàn)場快速檢測等方面看,使用2 ,62二氯靛酚乙酯顯色劑比用固藍B 鹽來顯色更具有優(yōu)越性.

進一步研究還發(fā)現(xiàn)了小麥酯酶活性與保存溫度的關系:在20 ℃儲存5 d 酶活只剩39. 6 %,在4 ℃儲藏5 d 剩余75. 6 %,酶活衰退較快,而將該酶用液氮在- 196 ℃保存8 d ,酶活仍有97. 5 % ,可見酶的保存需要較低的溫度. 近年來研究人員主要利用酶固定化技術解決酶液難以貯藏的問題,如用離子交換樹脂作為固定化載體對植物酯酶進行固定化,不僅可使酶的穩(wěn)定性大大提高,而且與游離酯酶相比,對農(nóng)藥抑制的響應敏感性也有明顯的提高.也有選用聚苯乙烯微孔反應板作為酶的載體,將自制的植物酯酶固定在載體上的微孔內(nèi)壁表面,制成農(nóng)藥快速檢測板,檢測有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度可達0. 01～0. 1 mg/ kg . 最近有報道采用原位溶膠2凝膠法制備PVA/ SiO2 有機/ 無機雜化溶膠,并將顯色劑和植物酯酶分散于溶膠中,制成一類親水2親丙酮可調(diào),貯存性好的傳感膜. 固定于該雜化膜中酶的穩(wěn)定性在冷藏和室溫條件下均比在溶液狀態(tài)下有明顯提. 由此可見,酶的固定化方法在檢測農(nóng)藥殘留中將起到非常重要的作用.

隨著人們對蔬菜中農(nóng)藥殘留及食品安全性問題的關注,只有不斷地更新和完善農(nóng)藥殘留的快速檢測技術,才能滿足人類對健康和食品貿(mào)易的要求. 而酶抑制法檢測有機磷農(nóng)藥殘留相對于傳統(tǒng)的波譜法,色譜法在簡便、快速和檢測成本等方面都有較大的優(yōu)越性. 基于動物膽堿酯酶的酶片法、分光光度法以及生物傳感器法,準確性和靈敏度尚好,其中近年來的研究熱點———生物傳感器法,我國還停留在研發(fā)階段,應著力解決其穩(wěn)定性、精確性等問題盡快將研究成果投入實際運用. 而相對于動物酶法,植物酯酶法在提取、保存、檢測成本上更勝一籌,且靈敏度和準確性上也不遜色,故在我國推廣很快. 但是不同的植物酯酶對有機磷農(nóng)藥的抑制強度不同,應探索更有效的分離純化方法并對其結(jié)構(gòu)進行研究,明確作用靶標部位,以期更大程度地提高植物酯酶的檢測靈敏度. 同時,應著力研制便宜、簡便和準確的速測儀器, 力求把殘毒超標的蔬菜、水果堵在食用之前.