農(nóng)作物種子純度鑒定方法綜述4

4．2 SSR(Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記)

由Moore等于1991年創(chuàng)立。SSR即微衛(wèi)星DNA，是一類(lèi)由幾個(gè)(多為1～5個(gè))堿基組成的基序(motif)串聯(lián)重復(fù)而成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，其長(zhǎng)度一般較短，廣泛分布于基因組的不同位置，如(cA)n、(AT)n、(GGC)n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來(lái)，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析技術(shù)比較擴(kuò)增帶在膠板的不同距離，來(lái)判斷不同生物體的特定SSR座位多態(tài)性，就可獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性即SSR標(biāo)記。

SSR標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：(1)數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因組；(2)具有較多的等位性變異；(3)共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；(4)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；(5)但是由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開(kāi)發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。

4．3 AFLP(AmpI ified fragment length polymorphism)

AFLP又名限制片段選擇擴(kuò)增技術(shù)(selective Restriction Fragment Amplification，SRFA)。AFLP標(biāo)記是選擇性擴(kuò)增基因組DNA酶切片段所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，其實(shí)質(zhì)也是顯示限制性內(nèi)切酶酶切片段的長(zhǎng)度多態(tài)性，只不過(guò)這種多態(tài)性是以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。該技術(shù)結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的簡(jiǎn)便高效性，同時(shí)又能克服RFLP帶型少、信息量小以及RAPD技術(shù)不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。其基本技術(shù)原理和操作步驟如下：首先用限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機(jī)限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭(0ligo nuleotideadapter)；然后根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物，由于限制性片段太多，全部擴(kuò)增則產(chǎn)物難以在膠上分開(kāi)，為此在引物的3’端加入1～3個(gè)選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對(duì)的片段才能與引物結(jié)合，成為模板被擴(kuò)增，從而達(dá)到對(duì)限制性片段進(jìn)行選擇擴(kuò)增的目的；最后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性擴(kuò)增產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)。

AFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：(1)由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類(lèi)、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無(wú)限多的；(2)典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50～100條之間，所以一次分析可以同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)座位，且多態(tài)性極高；(3)表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德?tīng)柺竭z傳；(4)分辯率高，結(jié)果可靠。(5)但目前該技術(shù)受專(zhuān)利保護(hù)，用于分析的試劑盒昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。

4．4 RAPD(Random amp I ification polymorphism DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記)

RAPD以PCR技術(shù)為背景，以人工合成的堿基順序隨機(jī)排列的寡核苷酸單鏈為引物(長(zhǎng)度為9～10個(gè)堿基)，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，然后用電泳技術(shù)，以檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性，這些擴(kuò)增片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的多態(tài)性。

RAPD標(biāo)記技術(shù)就是用隨機(jī)引物(一般為8～10個(gè)堿基)非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后用凝膠電泳分開(kāi)擴(kuò)增片段。遺傳材料的基因組DNA如果在特定引物結(jié)合區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變，就有可能導(dǎo)致引物結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。