大米直鏈淀粉含量測(cè)量和淀粉分子旋轉(zhuǎn)半徑的研究實(shí)驗(yàn)

        作為主要的能源物質(zhì)，淀粉是人類的主要食料。大米淀粉因其顆粒粒徑小，色澤白，易消化等優(yōu)異品質(zhì)，成為淀粉家族中頗為醒目的一員，正日益受到食品研究者和制造商的關(guān)注川。隨著農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)水平的提高和人們對(duì)高品質(zhì)、健康食品需求的增加，大米淀粉在食品工業(yè)中的需求不斷增大口大米淀粉的主要成分是直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉含量高的大米淀粉產(chǎn)品受熱糊化后容易老化，而含量低的產(chǎn)品易于糊化，不容易老化。直鏈淀粉含量低的大米蒸煮后表現(xiàn)為鉆性大、米飯軟且有光澤，而含量高的大米蒸煮時(shí)會(huì)吸收較多的水分而不斷膨脹，飯粒干燥、蓬松且色暗�？梢姶竺椎矸壑械闹辨湹矸凼怯绊懙矸酆�化、膠凝、老化等性質(zhì)的重要因素之一，不僅影響大米淀粉的蒸煮和加工特性，而且還影響到大米淀粉在作為添加劑和功能性組分方面的性質(zhì)。因此，使用直鏈淀粉測(cè)量?jī)x對(duì)大米直鏈淀粉進(jìn)行有效的分離，進(jìn)一步了解直鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)，以便建立起結(jié)溝與性質(zhì)的關(guān)系，已成為區(qū)分大米淀粉產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵。

       國(guó) 內(nèi)外 對(duì) 于淀粉分子結(jié)構(gòu)與品質(zhì)關(guān)系的研究由來(lái)已久。由于直鏈淀粉分子量巨大，沒有有效的溶劑溶解樣品.同時(shí)缺乏有效的手段從淀粉中分離直鏈淀粉，所以國(guó)內(nèi)幾乎沒有關(guān)于直鏈淀粉分子量的報(bào)道。而國(guó)外對(duì)于淀粉分子量的報(bào)道也因儀器分析方法的不同而千差萬(wàn)別[3到淚前為止，仍未能得到關(guān)于直鏈和支鏈淀粉分子量的確切信息。本實(shí)驗(yàn)通過使用流變儀控制不同直鏈淀粉含量的大米淀粉的升溫糊化過程，用浸出法分離出大米淀粉中的直鏈淀粉，并用高效液相分子排阻色譜(HPSEC)與多角度光散射儀(MALLS)及折光檢測(cè)器(R”連用系統(tǒng)分析分子量分布及分子旋轉(zhuǎn)半徑，旨在建立有效的分析直鏈淀粉分子量的方法，提供確切的直鏈淀粉分子結(jié)構(gòu)方面的信息，為國(guó)內(nèi)大米淀粉的工業(yè)化應(yīng)用提供幫助。
1 材料與方法
1. 1 試驗(yàn)材料
       大 米 淀 粉樣品:Cocodrie(直鏈淀粉含量21%),L-205直鏈淀粉含量17%)和Koshi(直鏈淀粉含量14%)由項(xiàng)目合作單位美國(guó)加州大學(xué)Davis分校食品系提供。

1.2 主要試劑和儀器
      二 甲亞 礬(DMSO)(色譜純，Sigma公司);濱化銼(分析純，F(xiàn)ishe:公司);葡聚搪分子量標(biāo)準(zhǔn)(T40和T2000,P harmacia公司)。高效液相色譜儀(HPSEC)(美國(guó)惠普公司)，化學(xué)工作站，自動(dòng)進(jìn)樣裝置;多角度光散設(shè)儀Dawn DSP-F (MALLS)(美國(guó)Wyatt公司);折光檢測(cè)器ERC-7512( RI) (日本ERMA公司);AR1 000流變儀(美國(guó)TA公司);UV1100分光光度計(jì)(北京瑞利公司)。

1.3 試驗(yàn)方法
1.3.1 樣品制備和處理
1) 標(biāo) 準(zhǔn) 樣品的處理:將20m g葡聚搪標(biāo)準(zhǔn)樣品(T40或T2000)溶解在5 mL DMSO/50 mmol/L     LiBr溶液中，配制成為濃度0.4 %的溶液。室溫下攪拌2h ,13500r /min離心10m in取上清液，經(jīng)過0.4 5K m的微孔膜濾后進(jìn)行HPSEC-MALLS-RI分析。
2) 淀 粉 樣品的制備和處理:20m g淀粉樣品溶解在5 mL DMSO/50 mmol/L LiBr溶液中，配制成為濃度。.400的淀粉溶液，加人磁力攪拌子，在磁力加熱攪拌器上，于90℃下加熱攪拌1h后于室溫下繼續(xù)攪拌24 h, 13500 r/min離心10 min后取一清液，經(jīng)過0.45Km的微孔膜濾后進(jìn)行HPSEC-MALLS-RI分析。
3) 直 鏈 淀粉樣品的制備和處理:根據(jù)Mua等的方法[s}加以修改。3%的淀粉樣品被置于AR10o0流變儀平臺(tái)上。流變儀的夾具選擇40,40 mm的錐板，夾縫設(shè)置為I mm,流變儀的程序選用穩(wěn)態(tài)流動(dòng)(Flowprocedure):50 C 保持1m in，接著從50℃以10C / min分別程序升溫到75'C,80C,85C和90'C ,剪切速率為200 a-',程序結(jié)束以后流變儀平臺(tái)上的樣品用吸管完全轉(zhuǎn)移至離心管中，以13500 r/min離心10 min后棄去沉淀取上清液即為直鏈淀粉樣品，取0. 2 mL上清液作波長(zhǎng)掃描分析，其余上清液經(jīng)過。. 45 jm的微孔膜濾后進(jìn)行HPSEC-MALLS-RI分析。

1.3.2 直鏈淀粉樣品的波長(zhǎng)掃描
        根 據(jù) Ch eethan的方法，并加以適當(dāng)修改進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。取直鏈淀粉樣品(上清液)0.2 m L，加人含。.006mol/L碘的90%的二甲亞礬溶液8 mL,在室溫下反應(yīng)24 h，其間不時(shí)攪拌溶液，再取1 mL溶液與8 mL去離子水混勻，靜置30 m。后，以試劑作為空白，在250-800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描Cs7
1.3.3 色語(yǔ)往和多角度光散射儀條件St yra ge l預(yù)飽和柱，Styragel HMW7, StyragelHMW6和Styragel HMW2柱(Waters公司);流動(dòng)相采用含有50 mmol/L LiBr的二甲基亞諷溶液;流速為0. 6 mL/min;柱溫用柱溫箱保持在40'C;多角度光散射儀的光源氣體使用氦氣和氖氣，波長(zhǎng)選用623. 8 nmC'7.
1.3.4 數(shù)據(jù)處理
         使 用 A stra( version 3.4 .W yatt Thchonlogy,Santa Barbara, CA)數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析
2.1 參數(shù)的設(shè)定和儀器的準(zhǔn)確性檢驗(yàn)
2.1.1 數(shù)據(jù)處理與參數(shù)的設(shè)定
         目前 ，凝膠色譜和排阻色潛是最廣泛應(yīng)用的測(cè)定分子量的兩種技術(shù)。通常需要已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，但在淀粉分子量M量中卻很難找到組成結(jié)構(gòu)和分子量與待測(cè)淀粉接近的標(biāo)樣。排阻液相色譜和多角度光散射儀、折光檢測(cè)器連用技術(shù)(HPSEC-MALLS-RI)使淀粉分子量的測(cè)定成為可能。當(dāng)一束光照射到某一介質(zhì)時(shí)，能夠在各個(gè)方向觀察到光強(qiáng)度，其散射光的強(qiáng)度與溶液中分子大小、形狀和分子間的相互作用有關(guān)。重均分子量Mw 和分子平均旋轉(zhuǎn)半徑的關(guān)系由以下公式來(lái)表示[CIO]
K' c / R ,= [1+ (16,r'/3A 2)<rg2> sin2(8/2)+幾 sin '(8 /2 ) + .. .]/ M u + 2 A, c式中Ra— 瑞利Rayleigh因子，表示散射角為0時(shí)的光散射強(qiáng)度;c- 高聚物溶液的濃度;Mw 高聚物的重均分子量;A,— 第二維利系數(shù)，代表了溶劑和溶液之間的相互作用大小;< rgz >— 平均旋轉(zhuǎn)半徑的平方;K' = 4 rr' no (d n/ dc) '/ ,VN e式中、— 溶液的折光指數(shù);do/dc— 在一定的波長(zhǎng)下，折光檢測(cè)器RI隨著高聚物濃度變化而發(fā)生的改變;N,,— 阿佛加德羅常數(shù);x— 人射光的波長(zhǎng)。當(dāng) 高 效 液相分子排阻色譜(HPSEC)與多角度光散射儀〔MALLS)及折光探測(cè)器〔RI)連用時(shí)，分子排阻就可以測(cè)得K' ,c,B,R。和A，而Mw, G rg2> 和A:則是需要通過計(jì)算求出的。在上式中，當(dāng)外推到濃度‘~。，散射角0-。時(shí)，則K' c /RB- 1/ Mw,1/ M u即為截距.由此可以得到mw.根據(jù)Millard等文獻(xiàn)記載[+7，采用多角度光散射儀測(cè)定高聚物分子質(zhì)量及平均分子半徑時(shí)，應(yīng)選用較小的散射角，本實(shí)驗(yàn)選擇最適角度為2，選擇散射角較小的1-V14個(gè)檢測(cè)器的數(shù)據(jù)。得到的檢測(cè)數(shù)據(jù)依據(jù)Berry提出的方法進(jìn)行曲線擬合甲用Astra數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2.1.2 儀器的準(zhǔn)確性檢臉
         葡 聚 糖 樣品T2000和T40首先作為標(biāo)樣進(jìn)入HPSEC-MALLS-RI體系以驗(yàn)證該體系的準(zhǔn)確性，并建立多角度光散射儀的各項(xiàng)參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)。圖1顯示的是其HPSEC-MALLS-RI色譜圖淀 粉 是 一個(gè)多分散體，有一個(gè)分子量分布范圍。圖1中呈拋物線分布的為折光檢測(cè)器檢測(cè)到的流動(dòng)相不同流出體積下的樣品的濃度，皇線性分布的為在各個(gè)濃度下對(duì)應(yīng)的分子量分布，可以看到最先流出的是分子量最高的部分，后流出的是低分子量部分，圖中的分子量呈從高到低線性分布。通過Astra軟件分析計(jì)算，由HPSEC-MALLS-RI系統(tǒng)測(cè)得的T2000和T40的重均分子量Mw分別為1.95X10‘和3.89X10'，與該兩種標(biāo)樣的實(shí)際重均分子量(2.0X10'和4.0X10')十分接近，說明由HPSEC-MALLS-RI體系結(jié)合Astra軟件通過second order Berry外推法測(cè)定高聚物的分子量分布具有較高的準(zhǔn)確性.因此，后面的測(cè)定均以葡聚搪樣品T200。和T40作為標(biāo)準(zhǔn)、即以其側(cè)定時(shí)的各項(xiàng)參數(shù)作為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)來(lái)設(shè)定多角度光散射儀的參數(shù)。
2.2 大米淀粉樣品的HPSEC-MALLS-RI分析
      淀 粉 在水 性溶劑中的溶解性很差，目前最常用的溶解淀粉的溶劑為二甲亞礬，研究表明，在二甲亞礬中加人少量水或加人一些分子質(zhì)量較小的電解質(zhì)有助于淀粉分子的溶解[3,12]，但是，已經(jīng)報(bào)道的大米淀粉的分子質(zhì)量存在非常大差異，大約為0.39X 103-7.510X103[3.12]。這一方面可能是大米來(lái)源不同造成的，另一方面也說明淀粉的真正分散利溶解還存在問題[13]。本實(shí)驗(yàn)小組在前期的研究工作中比較了不同溶劑對(duì)大米淀圖 2 為 Cocodrie大米淀粉的HPSEC-MALLS-RI圖譜。通過Astr。軟件析,Cocodrie大米淀粉的重均分子量Mw為9.2X10'，分子平均旋轉(zhuǎn)半徑為222. 6nm�？梢钥吹�，圖中只出現(xiàn)一個(gè)峰，即兩者在分子排阻色譜往中并沒有得到很好的分離。盡管直鏈淀粉和支鏈淀粉的分子量(Mw)存在很大的差異，但其旋轉(zhuǎn)半徑(RMS)非常接近.因此在通過高效液相分子排阻色譜(HPSEC)分離時(shí)，圖譜中對(duì)應(yīng)于直鏈和支鏈淀粉的兩個(gè)峰并沒有分開。分子量分布曲線表明，任一時(shí)間流出的樣品的分子量都沒有接近直鏈淀粉的分子量，實(shí)驗(yàn)得到的分子量，是直鏈淀粉和支鏈淀粉聚集以后的平均分子量。因此，無(wú)法實(shí)現(xiàn)直鏈和支鏈淀粉的分子排阻色譜的真正分離。只有事先將直鏈淀粉分離出來(lái)，才能有效的測(cè)定其分子量分布。

2.3 大米直鏈淀粉樣品的分離
      直 鏈 淀 粉在一定的溫度下可以從淀粉顆粒中游離出來(lái)并溶解在水中，而支鏈淀粉只有在完全糊化后才可以在水中良好的分散。直鏈淀粉的浸出溫度可以從淀粉糊化曲線中的起始糊化溫度到達(dá)峰值溫度之間的任意溫度區(qū)域進(jìn)行選擇。依據(jù)這一原理使用AR 1000流變儀控制大米淀粉的升溫糊化過程，在糊化起始溫度到峰值溫度之間的不同溫度取樣并離心，得到的上清液即為不同溫度下浸出的直鏈淀粉。3種 大 米 淀粉的糊化溫度和峰值溫度數(shù)據(jù)均由美國(guó)加州大米研究基金協(xié)會(huì)提供，見表1。對(duì)于直鏈淀粉含量較低的Koshi，其糊化溫度較其它兩種淀粉低，因此，實(shí)驗(yàn)分別在70C,75‘C,80C,85℃和90C取樣.而L-205和Cocodrie淀粉則分別在75C,80C,85C和90℃取樣，得到的樣品立即離心，棄去沉淀，取上清液進(jìn)行分析。上清液通過與碘顯色反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，經(jīng)過波長(zhǎng)掃描后得出其最大吸收波長(zhǎng)為640 nm，這些都是直鏈淀粉的特征閣，證明上清液中絕大部分為直鏈淀粉，而且在上述各個(gè)溫度下都有直鏈淀粉溶出。因此，用流變儀控制糊化升溫來(lái)分離直鏈淀粉是一種有效的方法。
2.4 大米直鏈淀粉樣品的RPSEC-MALLS-RI分析
      經(jīng) 過 分 離得到的直鏈淀粉再經(jīng)過HPSECMALLS-RI系統(tǒng)進(jìn)行分析，不同溫度下浸出的直鏈淀粉的分子量分布見圖3,可 以 看 到.對(duì)于Cocodrie直鏈淀粉，從75^90C,浸出的直鏈淀粉的分子量分布十分相似。而對(duì)于L-205和Koshi，在90℃浸出的直鏈淀粉的分子量分布與其它溫度相比較有明顯的不同。由于直鏈淀粉含量越低，越有利于淀粉顆粒的受熱膨脹，而高含量的直鏈淀粉，則會(huì)抑制淀粉顆粒的受熱膨脹[141 因此，在高溫下.低直鏈淀粉含量的淀粉顆粒更容易受熱膨脹直至破損，不僅直鏈淀粉會(huì)浸出溶解到溶液中甲也導(dǎo)致部分支鏈淀粉隨之溶出到溶液中，而溶出的支鏈淀粉很容易與鏈長(zhǎng)較長(zhǎng)的直鏈淀粉纏繞聚集。因此，在90℃時(shí)，當(dāng)取樣離心后，支鏈淀粉與長(zhǎng)鏈的直鏈淀粉的聚集體就很容易沉淀下來(lái)，當(dāng)取上清液進(jìn)行分子量測(cè)量時(shí)，會(huì)得到偏小的分子量分布，致使分子量分布直線向下偏離。所以，當(dāng)溫度高于90℃時(shí)，己經(jīng)不適于直鏈淀粉的分離。在低于90)C時(shí)，不同溫度下浸出的直鏈淀粉有十分相似的分子量分布。通過Astra軟件進(jìn)行計(jì)算處理后，可以得到不同溫度下浸出的直鏈淀粉的重均分子量(Mw)和分子平均旋轉(zhuǎn)半徑(RMS)，見表2,舍 去 高 溫 90V，從表2可以看到，經(jīng)過分離以后得到的直鏈淀粉的重均分子量范圍為3.29X 10'-2.75XIf]d，這比2. 2中未分離直鏈淀粉之前測(cè)得的淀粉的重均分子量小很多，也與文獻(xiàn)報(bào)道的直鏈淀粉的分子量十分接近[-lsl。同時(shí)可以看出，L-205和Koshi在90,C得到的直鏈淀粉的Mw明顯低于在其溫度得到的直鏈淀粉的Mw，而Cocodrie卻與二者不同，在900C得到的直鏈淀粉的Mw與在其它溫度得到的直鏈淀粉的Mw相差不大，這與圖3中給出的分子量分布的結(jié)果是一致的。但是，分子平均旋轉(zhuǎn)半徑RMS并沒有隨溫度有顯著的變化。因?yàn)殡S著溫度的升高，雖然會(huì)有一小部分支鏈淀粉也隨著直鏈淀粉一起溶出并形成聚集體，但大部分聚集體經(jīng)過離心以后已經(jīng)被除去。

3 直鏈淀粉含量?jī)x分析試驗(yàn)結(jié)論
1) 直 鏈 淀粉和支鏈淀粉雖然在分子量上存在很大的差異，但其旋轉(zhuǎn)半徑非常接近，在通過高效液相分子排阻色譜(HPSEC)分離時(shí)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)直鏈和支鏈淀粉的有效分離。只有將直鏈淀粉分離出來(lái)，才能測(cè)定其分子量分布情況。
2) 用 流 變儀控制大米淀粉的升溫糊化過程，用浸出法來(lái)分離直鏈淀粉是一種有效的方法。高溫(高于9D C)不利于直鏈淀粉含量低的大米淀粉用浸出法分離直鏈淀粉，當(dāng)溫度低于90,C而高于糊化溫度時(shí)，各個(gè)溫度下均可用浸出法分離出直鏈淀粉，得到的直鏈淀粉具有十分相似的分子量分布、重均分子量和分子旋轉(zhuǎn)半徑。
3) 使 用 流變儀分離直鏈淀粉，結(jié)合高效液相分子排阻色譜(HPSEC)、多角度光散射儀(MALLS)及折光檢測(cè)器(RI)連用系統(tǒng)，能夠較準(zhǔn)確的測(cè)定出大米直鏈淀粉的分子量分布和分子旋轉(zhuǎn)半徑，與國(guó)外的研究比較[za]，更為簡(jiǎn)便快速·

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