葉綠素含量測定

    根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長下測定其光密度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。其中分光光度計(jì)采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

    根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的光密度D與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：
D=kCL。式中：k為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，k為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的比吸收系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的光密度而求得。

如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總光密度等于各組分在相應(yīng)波長下光密度的總和，這就是光密度的加和性。測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的光密度D，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。

已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，又知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：

D663 = 82.04Ca+9.27Cb （1）

D645 = 16.75Ca+45.60Cb （2）

式（1）、（2）中的D663和D645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時的光密度，Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以mg/L為單位。解方程組（1）、（2），得：

Ca = 12.72D663 – 2.59D645 （3）

Cb = 22.88D645 – 4.67D663 （4）

將Ca與Cb相加即得葉綠素總量（CT）：

CT = Ca + Cb =20.29D645 + 8.05D663 （5）

另外，由于葉綠素a、b在652nm的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），也可以在此波長下測定一次光密度（D652）而求出葉綠素a、b總量：

CT =（D652 × 1000）/ 34.5 （6）

在有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時測定出溶液中類胡蘿卜素的含量。

Lichtenthaler等對Arnon法進(jìn)行了修正，提出了80%丙酮提取液中三種色素含量的計(jì)算公式：

Ca = 12.21D663 – 2.81D646 （7）

Cb = 20.13D646 – 5.03D663 （8）

Cx·c=（1000D470 – 3.27Ca – 104Cb）/ 229 （9）

式中：Ca、Cb分別為葉綠素a和b的濃度；Cx·C為類胡蘿卜素的總濃度；D663、D646和D470分別為葉綠體色素提取液在波長663nm、646nm和470nm下的光密度。

由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計(jì)算公式也有所不同。葉綠素a、b在96%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據(jù)此列出以下關(guān)系式：

Ca = 13.95D665 – 6.88D649 （10）

Cb = 24.96D649 – 7.32D665 （11）

Cx·c=（1000D470 – 2.05Ca – 114.8Cb）/ 245 （12）

       葉綠素a的測定可通過在線測葉綠素a儀器，或者實(shí)驗(yàn)室型的熒光法測葉綠素a儀器。而葉綠素?zé)晒鉁y定儀更適合湖泊、水庫葉綠素a的測定。Turner Designs公司提供的Aquafluor手持式葉綠素?zé)晒鉁y定儀有兩種通道可以選擇：活體葉綠素a；藍(lán)綠藻（藻紅蛋白或藻藍(lán)蛋白）；濁度；若丹明WT；熒光素；銨；和萃取葉綠素a。

    而普通型的葉綠素測定儀，只需你把葉子夾在葉綠素儀中，然后通過按鈕就可看到葉綠素含量的值，方便又簡單。

  圖 葉綠素測定儀