SSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在構(gòu)建玉米DNA指紋庫上的應(yīng)用2

2玉米DNA指紋庫的構(gòu)建

2． 1利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建玉米DNA指紋庫

目前，國內(nèi)外對玉米種質(zhì)鑒定采用的遺傳標(biāo)記仍以形態(tài)標(biāo)記為主，參考同工酶和種子貯藏蛋白標(biāo)記。但形態(tài)標(biāo)記的表現(xiàn)受環(huán)境影響較大，鑒定工作量大，周期長，受季節(jié)限制。同工酶和種子貯藏蛋白標(biāo)記多態(tài)性不夠豐富，同工酶還存在組織和器官特異性，取材有嚴(yán)格的一致性要求，所以鑒定結(jié)果不夠穩(wěn)定。近年來發(fā)展較快的分子標(biāo)記是以DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，能穩(wěn)定遺傳，可反映生物的個體和群體特征。由于它直接反映DNA水平上的差異，具有高度的專一性和特異性，不同物種、同一物種不同品種所得DNA指紋各異，就像人類的指紋一樣，成為當(dāng)今最先進(jìn)的指紋鑒定技術(shù)。一種理想的分子標(biāo)記應(yīng)具有以下特點：多態(tài)性高；重復(fù)性和穩(wěn)定性好；帶型清晰，容易統(tǒng)計；在染色體上均勻分布；中性；共顯性；簡單快速，易自動化；開發(fā)和使用成本低廉。DNA指紋技術(shù)的發(fā)展日新月異，除以Southern雜交為基礎(chǔ)的RFLP外，近幾年已發(fā)展出了多種以PCR為基礎(chǔ)的新的DNA指紋技術(shù)，如RAPD、AFLP、SSR、SCAR和ISSR等及以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的SNP技術(shù)。但是，不同分子標(biāo)記的應(yīng)用價值不同(袁力行等，2000；Saliba-(Mombani et a1.,2000)。RFLP技術(shù)多態(tài)性較低，遺傳信息有限，需要的DNA模板量大，而且操作復(fù)雜。RAPD技術(shù)盡管具有簡單易行、需DNA量少、自動化程度高和實驗周期短的優(yōu)點，但對反應(yīng)條件較敏感，重復(fù)性差。AFLP具有多態(tài)性高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，但所需DNA模板量大，操作步驟復(fù)雜，同時它還是專利技術(shù)。與其他標(biāo)記相比，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR標(biāo)記在DNA指紋庫構(gòu)建上顯示了獨特的優(yōu)越性。SSR標(biāo)記數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，揭示的多態(tài)性高；具有復(fù)等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德爾方式遺傳，呈共顯性；每個位點由設(shè)計的引物序列決定，便于不同實驗室相互交流合作開發(fā)引物，獲得的資料能夠在不同的實驗室重復(fù)并共享(李新海等，2000)。雖然SSR引物的開發(fā)費用相當(dāng)高，但由于其巨大的應(yīng)用潛力，在一些主要農(nóng)作物中SSR引物的開發(fā)正在進(jìn)行中。目前，在玉米上已公開的SSR引物序列已達(dá)1800多對，并且每隔一段時間就有新的引物增加，為該技術(shù)在玉米DNA指紋圖譜中的應(yīng)用提供了良好的條件。

2．2玉米DNA指紋庫構(gòu)建的意義及其作用

我國國家種質(zhì)庫目前已搜集整理玉米種質(zhì)15967份，在生產(chǎn)上每年種植面積在5萬畝以上的玉米雜交種約300個，已申請植物新品種保護(hù)的玉米雜交種和自交系1000多個，每年參加國家區(qū)試及各省市預(yù)試的品種數(shù)以千計，通過國家和各省市審定的品種數(shù)百個(孫世賢等，2005)。同時，由于少數(shù)骨干親本的集中應(yīng)用，玉米品種間的遺傳差異越來越小，加之隨著轉(zhuǎn)基因等新技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用，在原品種基礎(chǔ)上僅改良少數(shù)甚至單個性狀的依賴性派生品種將增多。上述諸方面因素使得完全根據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行玉米品種的辨別越來越困難，給品種資源的收集、整理、鑒定篩選及品種的選育、保護(hù)及玉米開發(fā)中的種子生產(chǎn)、經(jīng)營、管理、維權(quán)等諸環(huán)節(jié)帶來不同程度的困難。鑒于上述種種問題，急需從DNA分子水平給予每個玉米雜交種和自交系以一個能夠準(zhǔn)確表明其身份的身份證號碼。與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)相比，DNA標(biāo)記技術(shù)能揭示更多的多態(tài)性，而且具有準(zhǔn)確可靠、簡單快速、易于自動化的優(yōu)點，這是品種鑒定實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的前提，也是品種鑒定技術(shù)的發(fā)展趨勢。

2．2．1玉米的品種鑒定及保護(hù)

在同一物種中的各個品種存在大量的多態(tài)性標(biāo)記，某一品種具有區(qū)別于其他品種的獨特標(biāo)記即一些特異性DNA片段的組合就稱為該品種的“指紋”，各品種的獨特的指紋片段構(gòu)成該物種的DNA指紋庫，它具有類似于人的指紋那樣的高度個體特異性和穩(wěn)定性。DNA指紋庫在作物育種中有著廣泛應(yīng)用：第一，每個品種DNA指紋差異可直接提供與目標(biāo)性狀有關(guān)的DNA水平的信息，避免了環(huán)境的干擾，從而能大大提高雜交種育種中對親本及后代理想單株的選擇效率；第二，通過檢測品種是否具有該品種特有的標(biāo)記指紋片段，可以有效地鑒定品種純度與真?zhèn)我约坝糜谛缕贩N登記和品種知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)等。在已有的DNA指紋技術(shù)和應(yīng)用基礎(chǔ)上進(jìn)行我國玉米品種標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋庫構(gòu)建的研究，這對保護(hù)玉米育成品種的知識產(chǎn)權(quán)和育種家的權(quán)益、提高種子市場的種子質(zhì)量具有重要意義。

2．2．2純度及真?zhèn)螜z測

在玉米雜交種生產(chǎn)與銷售過程中，建立以質(zhì)量檢測為中心的良種繁育與種子管理體系，對穩(wěn)定和推廣優(yōu)良品種起著重要作用。在國際標(biāo)準(zhǔn)及國家標(biāo)準(zhǔn)中，均采用種子純度、凈度、發(fā)芽率和水分4個質(zhì)量特性來衡量種子質(zhì)量并以此定級。在這4項指標(biāo)中，尤以品種純度為最重要。目前，我國玉米種子純度鑒定仍以形態(tài)鑒定、幼苗鑒定和田間小區(qū)種植鑒定為主，輔以同工酶和蛋白質(zhì)電泳技術(shù)。然而，玉米品種數(shù)量越來越多，種質(zhì)基礎(chǔ)卻越來越狹窄，原有的檢測方法已不能滿足實際需要，實踐中迫切需要開發(fā)新的檢測技術(shù)。DNA指紋技術(shù)因其分辨率高、重復(fù)性好和簡單快速等優(yōu)點適應(yīng)了這一需求。

2.2.3國家區(qū)試品種質(zhì)量監(jiān)控

DNA指紋技術(shù)在國家區(qū)試中主要應(yīng)用于以下3個方面：

(1)供試組合的一致性檢測。如果供試組合本身不具有一致性，就失去作為一個品種的最基本條件，不能稱為一個品種，當(dāng)然也就沒有進(jìn)行區(qū)試的必要。實踐中，某些育種者為了盡快推出品種，可能用未完全純合的早代系組配組合，這樣的組合在若干性狀上尚未穩(wěn)定，不宜在生產(chǎn)中推廣。如果能在區(qū)試之前或早期就將這類組合剔除，將減少許多不必要的工作，使有限的資源集中到有希望的組合上。利用形態(tài)性狀檢測因周期長(至少一個生長季)無法起到預(yù)控的作用，只有DNA指紋技術(shù)才可能做到這一點。

(2)監(jiān)控組合在不同區(qū)試年份是否發(fā)生更換。實踐中，某些育種者對第一年區(qū)試表現(xiàn)不是十分突出的組合，在第二年區(qū)試時用另一個組合代替。在很多情況下，兩個組合具有一個共同親本或親緣關(guān)系較近，因此形態(tài)性狀上差別不太明顯，不易區(qū)別。如何防止這種情況發(fā)生，保證區(qū)試的公正性和嚴(yán)肅性，是區(qū)試工作中面臨的重要問題之一。DNA指紋技術(shù)的高鑒別能力適應(yīng)了這一需要。