蛋白質(zhì)測(cè)定方法及其比較

      目前常用的有四種古老的經(jīng)典方法，即定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測(cè)定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）； 還有近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法——BCA法。其中Bradford法和Lowry法靈敏度較高，比紫外吸收法靈敏10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。6 O! d- J2 r) @; g* t& J4 m! I
這些方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這幾種方法測(cè)定，有可能得出幾種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。

一  凱氏定氮法

這種方法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當(dāng)時(shí)凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機(jī)氮化合物生成氨的反應(yīng)歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長(zhǎng)時(shí)間，后來由Gunning加入改進(jìn)，他改進(jìn)的辦法是在消化時(shí)加入K2SO4使沸點(diǎn)上升，這樣加快分解速度，因?yàn)闇囟扔稍瓉砹蛩岱悬c(diǎn)的380上升到400℃，提高了不到67℃所以速度也就加快了，凱氏定氮法至今仍在使用。

我們?cè)跈z驗(yàn)食品中pro時(shí)，往往只限于測(cè)定總氮量，然后乘以pro核算等數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗pro。

1 凱氏常量定氮法：

不論常量、半微量以及微量定氮法它們的原理都是一樣的，首先第一個(gè)步驟是消化：

（1）消化：樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機(jī)物脫水。并破壞有機(jī)物，使有機(jī)物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而pro則分解氮，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。

（2）在消化過程中添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機(jī)物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點(diǎn)330℃，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400℃，加速了整個(gè)反應(yīng)過程。此外，也可以加入硫酸鈉，氫化鉀鹽類來提高沸點(diǎn)。其理由隨著消化過程硫酸的不斷地被分解，水分的逸出而使硫酸鉀的濃度增大，沸點(diǎn)增加。加速了有機(jī)的分解。但硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會(huì)分解，放出氨而造成損失。

為了加速反應(yīng)過程，還加入硫酸銅，氧化汞或硒粉作為催化劑以及加入少量過氧化氫，次氯酸鉀作為氧化劑。但為了防止污染通常使用硫酸銅。

所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。

（1）蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。

（2）吸收與滴定：

蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計(jì)算出總氮量。

半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。 

1．操作步驟：

準(zhǔn)確稱取樣品中0.50-2.00g→于500ml凱氏瓶中→加10g無水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通風(fēng)櫥中先以小火加熱，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明無黑粒后，將瓶子搖動(dòng)一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→繼續(xù)消化30分鐘→至到樣液呈綠色狀態(tài)，停止消化，冷卻→加200ml水→連接蒸餾裝置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波動(dòng)珠數(shù)粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加熱→至到K氏瓶?jī)?nèi)殘液減少到三分之一時(shí)，取出用水沖洗→用0.1N  HCl滴定。

N（V2-V1）0.014
 
W
 
計(jì)算：

總氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W  ×  100

0.014----氮的毫克當(dāng)量數(shù)

pro%=總氮%×K

乳制品K=6.38（N=15.7%）

小麥粉K=5.79（N=17.6%）

動(dòng)物膠K=5.6（N=18.0%）

冰蛋K=6.7（N=14.8%）

大豆制品K=6.0（16.7%）    K=6.25則（N=16%） 

K-換稱等數(shù)

各種試劑的作用:

濃H2SO4：

A ：脫水使有機(jī)物炭化，然后有機(jī)物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變?yōu)镃O2

B： 氧化

C： pro與濃H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑

D： NH3與H2SO4生成硫酸銨

（1）CuSO4的作用（催化劑）

CuSO4為紅色沉淀，當(dāng)C完全消化后，反應(yīng)停止，紅色消失，變?yōu)樘m色，即為消化達(dá)到完全，蘭色為CuSO4的顏色

（2）K2SO4的作用（提高沸點(diǎn)）

沸點(diǎn)由330℃提高到400℃加速了反應(yīng)過程。

（3）硒粉和過氧化氫，氧化汞都為催化劑，但為了防止污染通常采用硫酸銅

（4）50%NaOH的作用

下面我就針對(duì)幾點(diǎn)來說明為何影響氨化完全和速度快的因素:

（1）K氏燒瓶和取樣量

如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對(duì)于縮短氨化時(shí)間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。

（2）分解劑

A    H2SO4和K2SO4的添加量

有機(jī)無分解需要H2SO4量，H2SO4應(yīng)根據(jù)有機(jī)物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

1g樣品     K2SO4：  H2SO4=7g：12ml

這種比例在國(guó)內(nèi)外都使用，是公認(rèn)的

還有一種比例：   K2SO4：H2SO4=10：20ml

B  催化劑

用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，對(duì)Hg，HgO有毒但結(jié)果好，Se與CuSO4得到結(jié)果是一種，TiO2，的結(jié)果偏低，采用不同的催化劑則消化時(shí)間不同， HgO消化麥子為38，Se與CuSO4消化麥子55，TiO2消化麥子70，所以在給出測(cè)定結(jié)果時(shí)要注明催化劑的類型。

（3）熱源的強(qiáng)度

消化時(shí)熱源的強(qiáng)度同迅速消化和完全氨化關(guān)系很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強(qiáng)導(dǎo)致H2SO4損失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，頸部的粗細(xì)和長(zhǎng)短等，也與熱源的強(qiáng)度有關(guān)。

（4）氨的蒸餾和吸收及滴定

蒸餾有兩種:

1.直接蒸餾（裝置簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性好）

2 .水蒸汽蒸餾

蒸餾加NaOH是50%，加的量為H2SO4量的4倍，硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48ml，而且一般高于這個(gè)理論值，即加到50~55ml，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強(qiáng)酸，使顏色變紅。

吸收液有：

1標(biāo)準(zhǔn)H2SO4 用標(biāo)準(zhǔn)堿返滴定，甲醛紅指示劑

2 硼酸  用HCl進(jìn)行滴定，混合指示劑

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強(qiáng)酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時(shí)，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險(xiǎn)期間一般用4%。

〈6〉實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

a.樣品應(yīng)時(shí)均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)，液體樣要混合均勻。

b.樣品放入K氏燒瓶時(shí)，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。

c.消化時(shí)，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。

d.在整個(gè)消化過程中，不要用強(qiáng)火，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

e.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會(huì)引起氨的損失，這時(shí)會(huì)形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當(dāng)硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時(shí)，要添加硫酸量。

f.混合指示劑在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色，如果沒有溴甲酚綠，可單獨(dú)使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。

g.氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。

h.向蒸餾瓶中加入濃堿時(shí)，往往出現(xiàn)褐色沉淀無。這時(shí)由于分解促進(jìn)劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時(shí)Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。

i.消化劑綠色后繼續(xù)消化30分鐘即可。

2.K氏微量定氮儀法

3.K氏半微量定氮儀法     (2 、 3原理一樣)

操作方法大同小異，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸餾吸收液吸收。

N（V2-V1）0.014
 
W＊１０／１００
 

計(jì)算總氮%=(N(V2-V1)×0.014)/(W×10/100)×100                                  

對(duì)于微量定氮儀法，儀器有了改進(jìn)，樣液稱樣少，蒸餾消化液也少，其它基本一樣。

4.K氏自動(dòng)定氮法

原理與上面一樣，儀器，采用K氏自動(dòng)定氮儀：其裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置，自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置，消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的K氏消化瓶以及紅外線裝置的消化爐。

二   水揚(yáng)酸比色法：

1.原理： 樣品中的pro經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水揚(yáng)酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長(zhǎng)660nm處比色測(cè)定，求出樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

2.方法   （１）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6個(gè)25ml容量瓶編號(hào)  0   1   2   3   4   5   6

分別加空白酸液                      2ml   

分別加磷酸鹽緩沖液              5ml

稀釋至總體體積至15ml    

分別加水揚(yáng)酸鈉                     5ml

37C水浴                                  15分鐘

加入次氯酸鈉                         2.5ml

37C水浴                                   15分鐘

取出試液于660nm下進(jìn)行比色，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品處理：

準(zhǔn)確稱樣0.20~1.00g→于K氏瓶中→加15mlH2SO4和5g催化劑→電爐上加熱到沸騰后→加大

火力消化→直到出現(xiàn)暗綠色時(shí)→搖動(dòng)瓶子→K氏瓶全部消化后→冷卻→加水至250ml容量

瓶。

（3）樣品測(cè)定：

準(zhǔn)確吸取上述消化溶液10ml→于100ml容量瓶中→定容→準(zhǔn)確吸2ml→于25ml容量瓶中→加

5ml磷酸緩沖液→以下操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟相同

并以試劑空白微對(duì)照，測(cè)得樣液的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其含氮量。

（4）計(jì)算

                            C×F

含氮%= ---------------------------× 100

                     W×1000×1000 

C---從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出測(cè)定樣液的含氮量（Ug）

F---樣品溶液的稀釋倍數(shù)

W---樣品重量（g）

pro%=總氮%×K（K可為6.25，也可查）

3.注意事項(xiàng)：

A 當(dāng)天消化液最好當(dāng)天測(cè)定，結(jié)果重現(xiàn)性好，如果樣液改至第二天比色就有變化。

                           

B 當(dāng)在PH和試劑適當(dāng)范圍內(nèi)加入氯源后，顏色的顯色和溫度有關(guān)，應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度。

                           

C 這種方法測(cè)定結(jié)果基本與K氏法一致。

4.試劑

（1）氯標(biāo)液：稱經(jīng)110℃干燥2h的硫酸銨0.4719g→于燒瓶中定容10ml→此液1ml相當(dāng)于

1.0mg氮標(biāo)液→使用時(shí)配制成1ml相當(dāng)于2.50Ug氮標(biāo)液。

（2）空白酸液：稱0.50g蔗糖→加15mlH2SO4和5g催化劑→與樣品一樣消化→定容250ml→

使用時(shí)吸收此液10ml→加水至100ml為工作液備用。

（3）磷酸鹽緩沖液：稱7.1g磷酸氫二鈉→加38g磷酸三鈉→加20g三九石酸鉀鈉→加400ml水

溶解→過濾→另稱35gNaOH溶于100ml水中→冷至室溫→緩緩地?cái)嚢杓尤肓姿猁}溶液中→加

入水稀釋至1000ml備用。

（4）水揚(yáng)酸鈉溶液：稱25g水楊酸鈉和0.15g亞硝基鐵氰化鈉溶于200ml水中過濾，加水稀釋

至500ml

（5）次氯酸鈉溶液：吸4ml安替富民液，用水稀釋至100ml

 5  儀器

（1）分光光度計(jì)

（2）恒溫水浴

三  紫外分光光度法

1.原理：

pro及其降解產(chǎn)物的芳香環(huán)基 ，在紫外區(qū)內(nèi)對(duì)某一波長(zhǎng)具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與pro濃度（3~8mg/ml）成直線關(guān)系，因此，通過測(cè)定pro溶液的吸光度，并參照事先用K氏定氮法分析的標(biāo)準(zhǔn)樣品，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。

2.試劑：

（1） 0.1mol/l檸檬酸水溶液。

（2）8mol/l脲[（NH2）2CO]的2NNaOH溶液。   脲的2N氫氧化鈉液

（3）  95%乙醇

（4） 無水乙醚

3.儀器

（1）   751型的紫外分光光度計(jì)

（2）   離心機(jī)

4.操作方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取樣品.2.00g，置于50ml燒瓶中，加入0.1mol/l檸檬酸水溶液30ml，攪拌30分鐘使其充分溶解，用四層紗布過濾于玻璃離心管中，以每秒鐘3000~5000轉(zhuǎn)的速度離心10分鐘，分別吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6個(gè)10ml容量瓶鐘，每個(gè)容量瓶，8mol/l脲的氫氧化鈉溶液充分搖2分鐘（如果離心再次離心），取透明液于比色皿中，在280nm下測(cè)定其吸光度。（做參比值）

以事先用K氏定氮法測(cè)定的樣品中蛋白質(zhì)的含量微橫坐標(biāo)上面的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取試樣1.00g→于50ml燒杯中→加0.1mol/l檸檬酸溶液30ml→攪拌10分鐘→四層紗布過濾到離心管中→用8mol/L脲的NaOH溶液定容，搖勻后于280nm下測(cè)吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出pro的含量。

計(jì)算：   蛋白質(zhì)= C/W×　100　　

C----從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的pro含量（mg）

W----測(cè)定樣品溶液相當(dāng)于樣品量（mg）

 

說明：

a.此法運(yùn)用于糕點(diǎn)，牛乳和可溶性pro樣品，測(cè)定糕點(diǎn)時(shí)，應(yīng)把表皮顏色去掉。

b.溫度對(duì)pro水解有影響，操作溫度應(yīng)控制在20~30℃。

四  雙縮脲法-皮尼克法

1 原理：

雙縮脲在堿性條件中，能與CuSO4結(jié)合成紅紫色的絡(luò)合物。pro分子中含有肽鏈與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也呈此反應(yīng)。本法直接用于測(cè)定像小麥粉等固體試樣的pro含量。但作為銅的穩(wěn)定劑，酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的pro能直接地一邊抽出一邊進(jìn)行定量。

2 試劑

⑴甘油作為穩(wěn)定劑：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈攪拌，同時(shí)加入4%CuSO450ml。

⑵酒石酸鈉作穩(wěn)定劑，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸鉀鈉溶液加到930ml水中，激烈攪拌，同時(shí)加入4%CuSO4液40ml。

配制以上兩種溶液、試劑，必須澄清，無氫氧化銅生成，否則重配。

3方法：樣品測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱0.6g樣品→使用試劑（1）

準(zhǔn)確稱0.5g樣品→使用試劑（2）

假如用試劑（2）

（1）準(zhǔn)確稱樣→0.5g→于80ml離心管→加1mlClC4→混合→加50ml酒石酸鉀鈉穩(wěn)定劑→蓋上蓋子離心10min（4000轉(zhuǎn)/分）→放置1小時(shí)→吸混合液15ml→于20ml離心管中→離心到完全透明→取上清夜5ml于→10ml容量瓶→加水定容→于550nm處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出pro含量。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按樣品測(cè)定方法，根據(jù)樣品中pro含量，取離心澄清樣液0.0  2.0  4.0  8.0  10.0ml于10ml容量瓶中→分別加水定容，按照樣品測(cè)定其吸光度。

事先用K氏定氮法測(cè)定樣品中pro含量為橫坐標(biāo)，以上述吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。